RAA联合CRISPR-Cas13a快速检测4种腹泻病原菌-安柏霖

目的,建立一种基于重组酶介导扩增技术(RAA)与分子信标相结合的病原菌恒温快速检测方法。方法方法学的建立。通过金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)所对应的基因设计相应引物及分子信标探针,不断调整引物浓度比例以确定最佳引物浓度比来进行不对称护增,利用不对称重组酶介导扩增并与分子信标探针杂交,通过琼脂糖凝胶电泳及荧光采集观测结果。将阳性质粒以 10 倍的梯度稀释,检测该方法的灵敏度。利用该 RAA杂交法检测大坪医院检验科微生物室保存的2016年12月的72 株包含金黄色葡萄球菌及葡萄球菌属其他种细菌的菌株,以检测该方法的特异性。在特异性实验基础上添加我室保存的2016年12月的39 例其他菌株进行 Kappa 一致性检验及临床诊断效能评价。结果当限制性引物与非限制性引物的浓度比例在1:20时,产生单链 DNA(sSDNA)的效率最高。不对称 RAA扩增与分子信标探针杂交的效率明显高于对称扩增。该方法的灵敏度为20拷贝/。RAA 杂交法能够将金黄色葡萄球菌与葡萄球菌属其他菌株区分,与传统金标准相比 Kappa为0.860,一致性良好。经过对 111株菌株的检测,该方法敏感度为 92.5%(37/40),特异度为 97.2%(69/71),阳性预测值为94.9%(37/39),阴性预测值为95.8%(69/72),阳性似然比为 33.04,阴性似然比为 0.077,约登指数为0.897。与传统金标准相比,Kappa 为0.902,两种方法一致性良好。结论通过对不对称 RAA 扩增条件的优化及与分子信标探针的结合,建立了 RAA杂交技术检测细菌 DNA的新方法,为恒温扩增应用于临床奠定基础。(中华检验医学杂志,2017.40:309-313)

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