重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增方法的建立及评价-江苏血防所.pdf

[摘要] 目的建立一种可用于隐孢子虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)方法,并对其检测敏感性和特异性进行评价。方法以隐孢子虫属特异性I8SrRNA核酸序列作为检测靶标,采用Amplx软件设计、合成引物及荧光检测探针,构建并优化RAA荧光反应体系:分别以不同拷贝数的含 18SIRNA靶序列的重组质粒,不同浓度隐孢子虫卵囊基因组 DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其敏感性;分别以隐孢子虫卵囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组 DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其特异性。结果成功建立了隐孢子虫检测RAA法,该方法可在39 ℃、20 min 内得到隐孢子虫属I8S rRNA基因片段的有效扩增。以不同拷贝数的含I8SrRNA 靶序列的重组质粒,不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板,该方法最低检出限分别为10拷贝L、1ppL和1个/50 μ1;以蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。结论成功建立了一种可用于检测隐孢子虫卵囊DNA的RAA法,该方法操作简便、反应快速,敏感性和特异性均较好。

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