重组酶介导的斯氏并殖吸虫等温扩增荧光检测方法的建立及检测效果初步评价

[摘要] 目的建立一种基于重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided isothermalamplification,RAA)技术的斯氏并殖吸虫快速核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫,卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,提取基因组 DNA进行分子鉴定。以斯氏并殖吸虫线粒体细胞色素e氧化酶亚基1基因(cytochrome coxidase 1,car1)基因序列作为靶序列设计、制备、筛选引物及探针。以河南省济源市和洛阳市宜阳县斯氏并殖吸虫囊蚴基因组 DNA为模板进行荧光RAA检测方法验证。以含斯氏并殖吸虫cox1基因序列的不同浓度重组质粒和斯氏并殖吸虫囊蚴基因组 DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;应用建立的荧光RAA法同时检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、华支睾吸虫和日本血吸虫基因组DNA,评价其检测特异性。结果从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,经分子鉴定和系统进化分析确认其与GenBank中并殖吸虫标准株基因序列具有同源性。成功建立了斯氏并殖吸虫荧光RAA检测方法,可在5min内扩增到河南省济源市和洛阳市宜阳县采集的斯氏并殖吸虫囊蚴基因组 DNA.而阴性对照无扩增。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低检出限为10拷贝/L.重组质粒,且均在5min 内出现阳性扩增;以基因组DNA为模板,可检测到的最低模板DNA浓度为10 pguL,且均在 10~15 min内出现阳性扩增。荧光RAA法检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、日本血吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果均为阴性。

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