双重荧光RT-RAA检测5种蚊媒病毒方法的建立_周冬根.pdf

摘要:目的建立快速筛査登革病毒(DENV),乙型脑炎病毒(JEV),寨卡病毒(ZIKV),黄热病毒(YFV)以及基孔肯雅病毒(CHIKV)5种蚊媒病毒的重组酶介导等温扩增(RAA)方法。方法分析上述5种病毒的保守基因作为靶标区域并引人人核糖核酸酶 P(RNaseP)基因作为内对照,设计6组特异性引物和探针,并根据引物二聚体和错配等生物信息学分析将6组引物和探针组合成3组双重荧光 RT-RAA 检测体系,在相同反应条件下进行检测。用5种病毒的体外转录 RNA 验证3组荧光 RT-RAA 检测体系的灵敏度,用疟原虫,汉坦病毒,汉城病毒以及流感病毒核酸验证方法的特异性:分别用中浓度(10*拷贝/),低浓度(I0拷贝/ml)5 种病毒的体外转录RNA验证3组双重荧光 RT-RAA 检测体系的重复性。结果通过生物信息学分析,将5种病毒和RNaseP组合为3组双重荧光 RT-RAA检测体系,分别为DENV与ZIKVJEV与YFV 以及 CHIKV与RNaseP，均在 39℃反应15 mi。3组双重荧光RT-RAA检测体系检测5种病毒体外转录 RNA 的灵敏度介于!~10'拷贝/|,其中检测 DENV,ZIKV 和 YFV的灵敏度均为」拷贝/L,JEV 灵敏度为 10 拷贝/L,CHKV灵敏度为 10°拷贝/l;3 组荧光 RT-RAA 检测体系均与其他病毒无交叉反应。5种病毒的中浓度体外转录 RNA的检出率均达到 100.0%,低浓度体外转录RNA也能达到 83.3%。结论本研究建立的检测方法具有良好的敏感性,特异性和重复性,可用于人体及蚊类样本中5种蚊媒病毒的查。

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