探针导向重组酶介导等温扩增法检测TB_rpoB基因突变的应用价值-CDC

【摘要】目的建立可快速检测 MTB rpoB基因516位点突变的探针导向重组酶介导等温扩增法(probedirected recombinase amplificatOn,PDRA)。方法设计4条探针[1条野生型探针(P-W)及3条突变型探针(P-GGC、P-GTC,P-TAC)和1条共同的下游引物,分别构建TB516-W,TB-516-GGC、TB-516-GTC和TB-516-TAC4种检测体系,在 39 ℃条件下恒温扩增 40 min。通过阳性网值时间判定 MTBrpoB基因 516位点是否发生突变及其突变类型;通过同一探针检测对应的重组质粒确定该检测体系的敏感度;通过不同探针检测某一种重组质粒,根据阳性阈值时间确定该检测体系的特异度。应用建立的PDRA方法检测6株利福平耐药MTB菌株和 35份MTB培养阳性的痰标本,并与一代测序结果进行比较。结果4种检测体系检测对应重组质粒的敏感度为1000拷贝/.4种检测体系的特异度良好,探针与靶序列完全匹配时,阳性阈值时间早;探针与靶序列不完全匹配时,阳性阙值时间晚,具有稳定的阳性阙值时间差值,体系TB-516-W,TB-516-GGC,TB-516-GTC和TB-516-TAC的阳性阈值时间差值分别为7.0、5.8、10.0.7.0min。PDRA检测6株MTB利福平耐药菌株和35份MTB培养阳性痰标本的结果与测序结果一致。结论本研究初步建立了可应用于MTB利福平耐药rpoB基因516位点突变检测的 PDRA方法,该方法检测敏感度高,特异度好,具有一定的实验室应用价值。

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